本标准代替GB/T 5009.211-2008《食品中的测定》^[1] 。

本标准与GB/T 5009.211-2008相比，主要变化如下:

—标准名称修改为“食品安全国家标准食品中的测定”;

—修改了菌种名称，由干酪乳杆菌改为鼠李糖乳杆菌;

—删除了培养基和用于盐降解的鸡胰腺供货信息;

—删除了附录B中酶解酪蛋白液的制备方法;

—增加了检出限和定量限。

本标准规定了食品中的测定方法。

本标准适用于食品中的测定。

是鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7169)生长所必需的营养素，在定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率(或吸度值)，根据含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中的含量。

注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

盐酸(HCl)

氢氧化钠(NaOH)

氯化钠(NaCI)

十二水合磷酸钠(Na3HPO4·12H2O)

七水合(Na2HPO4·7H2 O)

(K2 HPO4 )

三水合磷酸二氢钾(KH2PO4·3H2O)

七水合(MgSO4·7H2 O)

七水合(FeSO4·7H2O)

一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)

三水合乙酸钠(CH3CooNa·3H2O)

葡萄糖(C6H12 O6)

抗坏血酸(C6H8O6)

甲苯(C7H8)

无水乙醇(C2H6O)

鸡胰腺干粉：含γ~谷胺酸基水解酶

木瓜蛋白酶：酶活力≥5 U/mg

a一：酶活力≥1.5 U/mg

蛋白陈：含氮量≥10%

酵母提取物(干粉)：含氮量≥10%

琼脂。

磷酸缓冲液(0.05 mol/L, pH6.8)：分别称取4.35 g十二水合磷酸钠和10.39 g七水合，用水溶解并稀释至1L，混匀。加入2 mL甲苯，室温保存。临用前按大约5 mg/mL的比例加入抗坏血酸作为保护剂，加入量以pH达到6.8为宜。

乙醇溶液(20%，体积分数)：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。

氢氧化钠乙醇溶液(0.01 mol/L)：称取0.1 g氢氧化钠，用乙醇溶液溶解并稀释至1L,混匀。

氢氧化钠溶液((1 mol/L):称取：10 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L,混匀。

盐酸溶液((1 mol/L)：量取83.3 mL盐酸，用水稀释至1L_,混匀。

盐酸浸泡液：量取100 mL盐酸与50倍水混合。

鸡胰腺溶液：称取100 mg鸡胰腺干粉，加入20 mL磷酸缓冲液，摇匀。现用现配。

蛋白酶一液：分别称取200 mg木瓜蛋白酶和α-，加入20 mL磷酸缓冲液研磨至匀浆，3 000 r/min离心5 min。现用现配。

甲盐溶液：分别称取25 g和25 g三水合磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至500 mL,混匀。加入1 mL甲苯，2 ℃~4℃冰箱可保存1年。

乙盐溶液：分别称取10 g七水合、0.5 g氯化钠,0.5 g七水合和0. 5 g一水合硫酸锰，加水溶解并稀释至500 mL。加5滴盐酸，于2℃~4℃冰箱可保存1年。

琼脂培养基：按表1称量或吸取各试剂，加水至100 mL,混合，沸水浴加热至琼脂溶化。趁热用1 mol/L盐酸溶液和1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8士0.1。尽快分装，根据试管内径粗细加入3 mL~5 mL，液面高度不得低于2 cm。塞上棉塞，121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高压灭菌15 min。试管取出后直立放置，待冷却后于冰箱内保存，备用。

测定用培养液：可按附录A配制测定用培养液，也可直接由试剂公司购买效力相当的测定用培养基，用前按说明书配制。

标准品(C19 H19 N7 O6 )：纯度≥99%。

标准储备液(20.0μg/mL)：精确称取20.0 mg标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解并转

移至1 000 m工矛容量瓶中，定容至刻度。

标准储备液浓度标定：准确吸取1.0 m工矛标准储备液至5 mL矛容量瓶中，用氢氧化钠溶液定容至刻度。用紫外一可见分光光度计，于比色杯厚度1 cm，波长256 nm条件下，以氢氧化钠乙醇溶液调零点，测定3次标准溶液吸光度值，取平均值按式(1)计算标准储备液浓度。

.............(1)

式中:

c1—标准储备液中浓度，单位为微克每毫升(mg/mL) ;

A—平均吸光度值;

E—摩尔消光系数，数值为21 500;

M—相对分子质量，数值为441.12;

5—稀释倍数;

1 000—由克每升换算为微克每毫升的换算系数。

标定好的标准储备液储存于棕色瓶中，于2 ℃~4℃冰箱可保存两年。

标准中间液(0.200μg/mL)：准确吸取1.00 mL矛标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀后储存于瓶中2℃~4℃冰箱可保存1年。

标准工作液(0.200 ng/mL)：准确吸取1.00 mL标准中间液置于1 000 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。现用现配。

天平:感量为0.1 mg和1 mg

恒温培养箱：37℃士1℃

压力蒸汽消毒器：121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)

涡旋振荡器

离心机:转速)3 000 r/min

接种环

pH计：精度为士0.1

紫外-可见分光光度计

超净工作台

超声波振荡器

鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7169)

将菌种鼠李糖乳杆菌转接至琼脂培养基中，在37℃士1℃恒温培养箱中培养20 h~21 h，连续传种2代一3代。取出后放入2 ℃~4℃冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代1次，可传30代。

实验前将储备菌株接种至琼脂培养基中，在37℃士1℃恒温培养箱中培养20 h~ 21 h以活化菌株，用于接种液的制备。

注：保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代一3代以保证细菌活力。

试验前一天，取2mL标准工作液与4mL测定用培养液混匀，分装至2支5mL离心管中，塞上棉塞，于121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高压灭菌15 min后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中，于37℃士1℃恒温培养箱中培养20 h～21 h。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下用吸取0. 5 mL转种至另两支已消毒但不含的培养液中，于37℃士1℃再培养6h。振荡混匀，制成接种液，立即使用。

谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3 mm~0.5 mm)；肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。于1℃冰箱可保存1周。

形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料；以饮料为基质或添加量>100 μg/100 g的食品可采用直接提取法。

准确称取固体试样0.1 g~0.5 g或液体试样0. 5 g~2 g，精确至0.001 g，转入100 mL锥形瓶中，加入80 mL氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡2 h~1 h至试样溶解或分散，用水定容至刻度。

谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。

准确称取适量试样(约含0.2μg~2μg)，精确至0.001 g。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样2g~5g；蛋类、豆、坚果类、内脏、干制试样0.2 g~2 g;流质或半流质试样5 g~10 g。转入100 mL锥形瓶中，加30 mL磷酸缓冲液，振摇5 min后，具塞，于121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高压水解15 min。

试样取出后冷却至室温，加入1 mL鸡胰腺溶液;含有蛋白质、淀粉的试样需另加入1 mL蛋白酶-液，混合。加入3滴一5滴甲苯后，置于37℃士1℃恒温培养箱内酶解16 h~20 h。取出，转入100 mL容量瓶，加水定容至刻度，过滤。 另取一只锥形瓶，同试样操作，定容至100 mL，过滤。作为酶空白液。

注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底含量，可采用酶解法提取。

根据试样中含量用水对试样提取液进行适当稀释，使试样稀释液中含量在0.2 ng/mL~0.6ng/mL范围内。

所用试管使用前洗刷干净，沸水浴30 min，沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2h，经170℃±2 0C烘干3h后使用。

取3支试管，分别加入0.5 mL、1.0 mL、 2.0 mL试样稀释液(V)，补水至5.0 mL。加入5.0 mL测定用培养液，混匀。另取3支试管同法加入酶空白液。

取试管分别加入标准工作溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、

2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL，补水至5.00 mL，相当于标准系列管中含量为0.00 ng、0.05 ng、 0.10 ng、0.20 ng、0.30 ng、0.10 ng、0.50 ng、0.60 ng、0.80 ng、1.00 ng，再加入5.0 m L测定用培养液，混匀。为保证标准曲线的线性关系，应制备2套一3套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。

将所有测定系列管塞好棉塞，于121 ℃ (0.10 MPa～0.12 MPa)高压灭菌15 min。

待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，用预先高压灭菌的移液管向每支测定管加接种液20μL，混匀。塞好棉塞，置于37℃士1℃恒温培养箱中培养20 h～10 h，直至获得混浊度，即再培养2h透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准0管(含0.00 ng)不接种作为0对照管。

将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1 cm比色杯，于510 nm处，以未接种0对照管调节透光率为99%(或吸光度值为0)，依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管有明显的细菌增长;或与0对照管相比，标准0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.1以上)，或标准系列管透光率变化量<40%(或吸光度值变化量<0.4），说明可能有杂菌或不明来源混入，需重做实验。

注:测定适宜的光谱范围540 nm～610 nm。

标准曲线:以标准系列管含量为横坐标，每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标，绘制标准曲线。

试样结果计算:从标准曲线查得试样或酶空白系列管中的相应含量(Cx)，如果3支试样系列管中有2支含量在0.10 ng~0.80 ng范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中含量的偏差小于10%，则可继续按式(2)、式(3)、式(4)进行结果计算，否则需重新取样测定。

试样稀释液浓度按式(2)计算:

............(2)

式中:

c—试样稀释液中浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

Cx—从标准曲线上查得试样系列管中含量，单位为纳克(ng);

Vx—制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升(mL) 。

采用直接提取法的试样含量按式(3)计算:

..........(3)

式中:

X——试样中含量，单位为微克每百克(μg/100g）;

c—试样稀释液浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/ml) ;

V—试样提取液定容体积，单位为毫升(ml) ;

f—试样提取液稀释倍数;

m—试样质量，单位为克(g};

—由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(μg/100g)的系数。

采用酶解提取法的试样含量按式(4)计算:

.........(4)

式中:

X—试样中含量，单位为微克每百克(μg/100g);

c—试样稀释液中浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

f—试样提取液稀释倍数;

c0—酶空白液中浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—试样提取液定容体积，单位为毫升(mL) ;

m—试样质量，单位为克(g};

_由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(μg/100g)的系数。

注1:液体试样含量也可以微克每百毫升(μg/100 ml)为单位。

注2:测定也可采用预包埋菌种的测定用试剂盒(微生物法)，测定过程应参照试剂盒说明书，效果相当。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不得超过算术平均值的15%;营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不得超过算术平均值的5%。

果蔬类试样称样量为5g时，检出限为0.2μg/100g，定量限为0.4μg/100g;蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时，检出限为1.0μg/100g，定量限为2.0μg/100g;营养强化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为0.5 μg/100g，定量限为1.0μg/100g。^[2]