技术简介

高速逆流色谱（high speed countercurrentchromatography，简称HSCCC）是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、、快速和大制备量分离等优点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。我国是继美国、日本之后早开展逆流色谱应用的国家。张天佑等在*先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪，对我国中药功能成分的分离制备取得了显著成果。上海同田生化技术有限公司生产的高速逆流色谱仪，分离中药成分纯度达到99%，可用于HPLC检测标准样。

高速逆流色谱 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种连续的液—液分配色谱分离技术， 它不用任何固态的支撑物或载体。 它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。

由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。

它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、、快速、制备量大、费用低等优点。HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域， 特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技 术；适合于中小分子类物质的分离纯化。

我国是继美国、日本之后早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA食品和药物管理局（Food and Drug Administration）及世界卫生组织（ WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定， 90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。

1原理

1.　逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）

但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。

2. 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相

2.通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率，1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程。

上表中是根据被分离物质的极性列出一些基本的可供参考的溶剂体系，它包括非水体系和含水体系。

溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。通常来说，溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子大于或等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、lv仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，终选择合适的溶剂系统。

2影响因素

1.固定相的保留值

在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。

仪器对保留值的影响（外因） 研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力条件的影响。

溶剂体系物理因素对保留值的影响（内因）

溶剂体系的物理因素如溶剂的黏度对固定相的保留影响很大，低黏度的溶剂体系可望得到高的固定相保留，界面张力和两相间的密度差会对溶剂在临界点附近的分层时间产生较大的影响，一般为保证固定相保留值合适，溶剂体系的分层时小于30s。

2. 转速的影响

螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就是对固定相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。当然，并不是转速越快越好，一般对于分配得不是太好的溶剂体系，如两相体系带有lv仿的，还要固定相分层比较慢的两相体系，通常情况下转速越高，越易产生乳化现象。

3. 流速的影响

流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流失加重，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。

4.温度的影响

温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是有机溶剂，沸点很低。

5. 相联检测技术

可见光检测、紫外光检测技术在HSCCC中应用较多。但有时由于组分对可见光或紫外光无吸收，或是固定相的流失导致流出液乳化，故无法用常用光学检测器检测。现己出现了HSCCC与质谱（MS）、电子电离质谱（EI-MS）、化学电离质谱（CI-MS）快速原子轰击质谱（FAB-MS）、热喷雾质谱（TSP-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS）的联用。

3技术发展

二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。Ito及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后Ito把流通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测和收集，并建立了两个基本的流通体制。其中有在比较简单的流体静力学平衡体制HDES基础上开发的作为分析分离的CCC、用作制备分离的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流体动力学平衡体制HDES为基础，研制出在重力场作用下的大制备量分离仪器和在离心力场作用下的分析型和半制备型分离仪器。

4研究发展

溶剂体系的选择范围越来越宽泛，有人提出用超临界二氧化碳做流动相，利用它的高扩散性、低粘度、流体特性及环境友好等其他溶剂不可比拟的优势分离化合物，还有人提出用制冷剂做流动相的可能性。还有人提出将三相溶剂体系用于高速逆流色谱分离中，可以对宽极性范围的样品进行很好的分离。三相溶剂还只用于标准品混合物的分离，

还没能用于具体天然产物的分离，相信进行进一步的发展在复杂天然产物以及药物的分离中有很大应用前景。 pH区带逆流色谱是一种发展起来的制备色谱技术，它能使样品的负载容量提高10倍以上，即使含量很低的物质也能得到高度浓缩。它是在固定相和流动相中加入一对试剂——保留剂和洗脱剂，保留剂用来把样品中的各组分保留在管柱内，当含有洗脱剂的流动相以一定流速穿过固定相时，由于酸碱反应终达到平衡。以保留剂在两相中的浓度比标度分配系数保留剂的分配系数，溶质的分配系数与标度值的差异决定了溶质的出峰时间，根据不同组分的Pka和疏水性的不同而实现分离。其色谱峰呈逐一连接的高度浓缩的重叠很少的矩形峰状，很像替代色谱的色谱峰形。

离子对逆流色谱是在固定相中加入适当的配体，以提高溶质在固定相中的保留值，改进峰分离度，已广泛用于天然药物中肽类成分、生物碱与氨基酸等的分离。

二元模式逆流色谱法以同一两相分配溶剂系统洗脱，既可用于正相洗脱也可用于反相洗脱。

HSCCC与质谱等其他技术的联用也是当前的研究热点，它把HSCCC分离的多样性与质谱的高灵敏度检测和结构分析特性良好地结合在一起，前景十分看好。为了克服HSCCC理论研究相对滞后的不足，有不少研究人员正从事理论研究，试图建立完善的理论基础来指导溶剂体系的选择，以期使HSCCC尽快从一种分离技术发展成为一门分离科学。

HSCCC一种*的不用固态载体的液液分配色谱技术，是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术，能采用多种多样的溶剂系统对任何极性范围的样品进行分离，能实现从微克、微升量级的分析分离到上百毫克、数克量级的制备提纯，适用于未经严格处理的大量粗制样品的中间级分离，也能与质谱仪、红外光谱仪等分析仪器联用进行高纯度分析，应用前景十分广阔。