生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法

组织型纤溶酶原激活剂（Tissue Plasminogen activitor，简称t-PA）是人体血液中凝血和溶纤系统的重要组分之一，它通过激活血栓表面的纤溶酶原而启动溶纤系统，在维持凝血和溶纤平衡中起着重要作用。t-PA由血管内皮细胞合成，新合成的t-PA前体由562个氨基酸残基组成，在多肽的翻译、分泌和成熟过程中，N端的信号肽和前导肽被切除，成熟的t-PA分子含527个氨基酸残基，分子量为67-72KD，由单条肽链组成，含17个二硫键。在溶纤过程中，t-PA分子在Arg275-Ile276位置被蛋白酶切割，形成活性更高的双链分子，N端275个氨基酸残基形成重链，C端252个氨基酸形成轻链，轻、重链之间由一个二硫键相连。重链含4个结构域，它们分别与其他一些血浆蛋白的某些功能域高度同源，所述的4个结构域分别是：1、指形区（又称F区），由4～46位氨基酸残基组成，与纤维结合素（fibronectin）的指形区同源，含纤维蛋白结合位点。2、表皮生长因子区（又称E区），由47～85位氨基酸残基组成，序列与表皮生长因子同源，含细胞膜受体结合位点。该区介导t-PA与肝细胞和血管内皮细胞结合，对半衰期有重要影响。3、K1区，由92～173位氨基酸残基组成。4、K2区，由180-261位氨基酸残基组成，含纤维蛋白结合位点。轻链与高度同源，含蛋白酶结构域，由His322、Asp371和Ser478组成活性中心，催化纤溶酶原转化成纤溶酶。t-PA分子含4个可能的糖基化位点：Asn117、Asn184、Asn218、Asn448。天然型t-PA分子含除Asn218外的其他三个糖基位点。根据糖基化的方式可将t-PA分子分为两个型：I型在三个位点均糖基化，II型则在Asn184位点无糖基化，二者在体内的含量基本相同。

t-PA在体内至少和以下4种不同蛋白质相互作用：1、纤溶酶原，它是t-PA的底物，在无纤维蛋白时，t-PA与它仅有较低的亲和力。2、纤维蛋白，t-PA分子与其有较高的亲和力，并且在与其结合后t-PA的蛋白酶活性可提高100倍左右。3、纤溶酶原激活剂抑制物PAI，t-PA与其结合后蛋白酶活性受抑制。4、t-PA受体，存在于肝细胞和血管内皮细胞表面，介导t-PA在体内快速清除。由于t-PA与纤维蛋白具有高度亲和力并且其活性可被纤维蛋白大大提高，因此，它在一定的浓度范围内只激活血栓附近的纤溶酶原，使血栓溶解，而不会引起全身的出血倾向，因此t-PA比其他的纤溶酶原激活剂更加安全有效。

重组人组织型纤溶酶原激活剂是利用基因工程方法对上述天然蛋白进行改造而得到的突变体或嵌合体。其中，TNK-tPA突变体的突变位点及其相应的功能分别是：

上述TNK-tPA突变体与天然型相比，对抑制剂PAI-1的拮抗能力增强了80倍；与纤维蛋白结合能力是天然型的10～14倍；血浆清除速度降低了4倍。

截至2002年7月，通常采用大肠杆菌系统表达t-PA缺失突变体，该技术是通过DNA重组技术，缺失天然t-PA分子的部分功能域，如F区、E区、K1区，使之仅含有K₂功能域和蛋白酶功能域。此缺失突变体t-PA是一个单链、非糖基化的分子，在大肠杆菌中表达。相对于天然t-PA，其在体内的半衰期延长了4～5倍，但与纤维蛋白的结合能力降低了5倍。因此在临床应用上有一定的局限性。

对于重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rhTNK-tPA的生产方法2002年前尚无文献报道。^[2]

《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》的目的是提供一种生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法。

《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》采用全长基因合成的方法合成含上述突变位点的TNK-tPA基因，在中国仓鼠卵巢细胞（CHO-DHFR^-）中表达，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株，利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经一系列柱层析分离纯化技术，获得rhTNK-tPA制品。

《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》依次包括以下步骤：

（1）定点突变天然t-PA基因获得含突变位点的TNK-tPA突变体基因；

（2）构建表达载体pCdhfr；

（3）以XhoI/XbaI双酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，与以XhoI/XbaI双酶切的真核表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coliJM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，取阳性克隆株培养，得到重组表达质粒pCdhfr-mt-PA；

（4）以TNK-tPA突变体表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO（dhfr^-）细胞，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株；

（5）利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经分离纯化获得rhTNK-tPA突变体。^[2]

1、《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》的目的基因在细胞中的表达水平高达18000IU/10⁶cell/d。

2、按照《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》的分离纯化工艺制备的rhTNK-tPA的单链比例高达80％以上，纯度高达95％以上。

3、对于工业化规模而言，《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》所需的设备相对比较简单，成本低，工艺条件简单。^[2]

图1是《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》的实施例中TNK-tPA真核表达质粒的酶切分析图。^[2]

《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》涉及一种生产重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体的方法，特别是涉及一种利用动物细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体（简称rhTNK-tPA）的工艺方法。^[2]

1.生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，依次包括以下步骤：

（1）定点突变天然t-PA获得含突变位点的TNK-tPA突变体基因；

（2）构建表达载体pCdhfr；

（3）以XhoI/XbaI双酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，与以XhoI/XbaI双酶切的真核表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coliJM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，取阳性克隆株培养，得到重组表达质粒pCdhfr-mt-PA；

（4）以TNK-tPA突变体表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO（dhfr^-）细胞，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株；

（5）利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经分离纯化获得rhTNK-tPA突变体。

2.根据权利要求1所述的生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，其特征是：所述的表达载体pCdhfr是由pCI-neo改构而成，pCdhfr的dhfr基因cDNA来源于质粒pSH2；pSH2用BglII消化后，Klenow酶补平3′凹端，再用HindIII酶切，于低熔点琼脂糖中分离0.7kb的片段；载体pCI-neo先用BstXI酶切，然后用T4DNA聚合酶削平3′凸端，再用HindIII酶切，采用三片断相连，将上述0.7kb的dhfr基因亚克隆到HindIII/BstXI位点，得到携带dhfr的共扩增表达载体pCdhfr。

3.根据权利要求1所述的生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，其特征是：在所述的步骤（5）中，rhTNK-tPA突变体的分离纯化步骤依次为：

（1）过滤；

（2）Zn⁺⁺--POROS20MC螯合层析纯化；

（3）LysineHyperD亲和层析；

（4）SephadexG-25凝胶过滤层析。^[2]

1、工程细胞株的构建

1.1材料、方法和结果

11.1材料

1.1.1.1菌种

E.coliXL1-Blue（基因型hsdR17，supE44，recA1，endA1，gyrA46，thi，relA1，lac/F′[proAB+，lacIq，lacZDM15∷Tn10（tetr）]）。

1.1.1.2细胞系

CHO（dhfr^-），二氢还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞。

1.1.1.3工具酶

各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、TaqDNA聚合酶，均购自Promega公司。VentDNA聚合酶购自Biolab公司。DNA分子量标准DL2000（2000，1000，750，500，250，100bp）及lamda-DNA/EcoRI（23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125bp）购自宝生物工程大连有限公司。

1.1.1.4主要试剂

1.1.1.4.13mMHT（次+胸腺嘧啶）浓缩液

次（购自Sigma公司）40.83毫克，胸腺嘧啶（Sigma公司）72.7毫克，加纯水50毫升，逐滴加入1N*。

1.1.1.4.2IMDM培养液

IMDM粉（购自Hyclone公司）17.7克，NaHCO₃2.0克，加入950毫升纯水，搅拌至溶解，以1NHCl调pH至7.6，加水至1000毫升，4℃保存，使用前加10％的透析胎牛血清（购自Hyclone公司）及双抗。

1.1.1.4.3磷酸盐缓冲液（PB）

1.1.1.4.4牛溶液

取10000U/支（购自Sigma公司），用PB稀释至330U/毫升，分装，-20℃保存备用。

1.1.1.4.5牛纤维蛋白溶酶原溶液（P液）

取牛纤维蛋白溶酶原（100U/支，购自Sigma公司），加PB稀释至0.1毫克/毫升，分装，-20℃保存备用。

1.1.1.4.6牛纤维蛋白原溶液（F液）

将-20℃保存的纤溶酶原放置室温半小时以上，称取所需量溶于煮沸后降至37℃的PB缓冲液中，使其终浓度达2毫克/毫升，37℃保温至溶解。

1.1.1.4.7标准品溶液制备

取标准品，用PB稀释至以下浓度，3000IU、1500IU、750IU、375IU、187.5IU、93.25IU/毫升。

1.1.1.4.8TNK-tPA样品的稀释

取待检样品，用PB稀释至0.1微克/毫升左右。

1.1.2主要仪器设备

11.3方法与结果

11.3.1目的基因的获得

利用点突变技术定点突变天然t-PA基因，采取全长基因合成的方法合成含突变位点的TNK-tPA基因，即：将天然型t-PA基因（wtPA）编码第103位Thr的ACG碱基变为AAC/Asn（T103N），可以在此位点（K1区）形成一个人工的糖基化位点，该位点的形成导致t-PA在体内被清除的速度下降，然而该位点的突变导致与纤维蛋白的结合能力下降，从而降低其特异性；通过将117位AAC/Asn突变为CAA/Gln（N117Q），可以消除上述103位糖基化所造成的不利影响；此外，将天然型t-PA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR（296-299）AAAA]，可以增强其结合纤维蛋白的能力，并降低其对PAI-1（t-PA抑制剂）的敏感性。

根据天然型t-PA的cDNA序列，设计上述突变位点，分别位于t-PA蛋白的103、117、296-299位氨基酸，导致上述位点的氨基酸与天然型t-PA不同。同时，在基因的上下游分别引入XhoI和XbaI限制性内切酶位点，基因全长为1.7kb，由宝生物工程大连有限公司合成。

11.3.2表达载体pCdhfr的构建

该表达系统所用的表达载体pCdhfr由pCI-neo改构而成。pCdhfr的dhfr基因cDNA来源于质粒pSH2。pSH2用BglII消化后，Klenow酶补平3’凹端，再用HindIII酶切，于低熔点琼脂糖中分离0.7kb的片段。载体pCI-neo先用BstXI酶切，然后用T4DNA聚合酶削平3’凸端，再用HindIII酶切，采用三片断相连，将上述0.7kb的dhfr基因亚克隆到HindIII/BstXI位点，得到携带dhfr的共扩增表达载体pCdhfr。

由于表达载体pCdhfr含dhfr基因，该质粒转染CHO（dhfr-）细胞后，在氨甲喋呤（MTX）的作用下拷贝数下大大增加，可以带动该质粒携带的外源基因的高效表达。该质粒含有多克隆位点，可用于外源基因的克隆，多克隆位点的上下游分别含有CMV启动子和SV40Poly（A）位点，这些序列可使插入多克隆位点的外源基因获得有效的表达。该质粒上还含有大肠杆菌的复制起始点和氨苄抗性基因，它们可以使该质粒在大肠杆菌中扩增。

1.1.3.3TNK-tPA重组质粒的构建及鉴定

以XhoI/XbaI双酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，与以XhoI/XbaI双酶切的真核表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coliJM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，取阳性克隆株培养，小量、快速提取质粒，酶切分析其插入片段，结果表明：外源目的基因正确插入到表达载体中，得到重组表达质粒pCdhfr-mt-PA，其酶切分析如图1所示。

同时，为了确认表达质粒中所插入的基因为TNK-tPA基因，并且其插入方向、DNA序列与设计的一致，对插入序列进行分析。结果表明，所插入的基因片段的序列与设计的一致。

1.1.3.4CHO（dhfr-）细胞的转染及高表达细胞株的筛选

CHO（dhfr-）细胞的转染采用脂质体法，转染用试剂盒LipofectAminePlus购自LifeTechnologies公司，转染操作参照试剂盒说明书。

以TNK-tPA突变体表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO（dhfr-）细胞，以含双抗的选择性培养液培养，每隔三天换一次培养液，直到大部分细胞死亡并从培养板上脱落，少数整合外源基因的细胞克隆在选择性培养液上存活下来，并不断分裂形成细胞集落（克隆）。从转染到细胞克隆的形成需要2周时间。在细胞克隆生长过程中，收集各孔培养上清，检测表达产物。选取表达量高的克隆，以消化，重新分入细胞培养板中，换用含MTX的选择培养液进行培养，在培养过程中，大部分细胞死亡，又有少数细胞形成新的克隆。重复上述操作，将MTX浓度提高一个水平，在克隆的筛选过程中，MTX浓度从5×10^-8M逐步提高到5×10^-6M，相应地，t-PA表达水平也逐步提高，如表1所示。

表1 MTX加压筛选过程中TNK-tPA表达水平的变化

从以上结果可以看出：当药物MTX浓度超过1×10^-6M时，TNK-tPA表达量不再明显升高，因此我们选择MTX浓度为1×10^-6M时筛选到的细胞株2A6作为工程细胞株，命名为CHO-G10。

2、工程细胞在细胞培养生物反应器中的培养和目的蛋白的分离纯化

2.1材料、方法和结果

2.1.1材料

2.1.1.1胎牛血清

为Invitrogenlifetechnologies公司的透析型胎牛血清。

2.1.1.2小牛血清

为Hyclone公司的加强型小牛血清。

2.1.1.3细胞培养基

所使用的IMDM和CHO-S-SFMII无血清培养基均为Invitrogenlifetechnologies公司产品。

2.1.1.4纯化填料

所使用的纯化填料POROS20MC、LysineHyperD和SephadexG-25分别是PE公司、Invitrogenlifetechnologies公司和AmershamPharmacia公司的产品。

2.1.1.5主要试剂

（1）为Hyclone公司产品

（2）咪唑为天津科密欧科技公司产品。

（3）L-Arginine为Invitrogenlifetechnologies公司产品。

（4）正磷酸为广州化学试剂厂产品。

（5）氯化钠为广州化学试剂厂产品。

（6）Tween20为SIGMA公司产品。

21.2方法与结果

2.1.2.1细胞复苏

按常规细胞复苏方法：从细胞库中取出一支冻存细胞，迅速置37℃水浴中，边轻轻摇动边融化，待融化完毕后，立即消毒冻存管外壁，在洁净工作台内将细胞悬液转移到约10毫升含有10％胎牛血清的IMDM培养基的细胞培养方瓶（T25）中，于37℃的5％CO₂孵箱中培养，第二天更换新鲜培养基，继续培养1～2天后，在倒置显微镜下观察细胞形态和密度，细胞折光性好、贴壁均匀、铺满瓶底85％以上时，即可进行细胞传代扩增。

2.1.2.2细胞扩增

包括细胞在方瓶中的扩增和细胞在细胞培养生物反应器中的扩增两部分。

首先，将T25中的细胞用消化后，按1:1的比例传入T75细胞培养瓶中，培养1～2天，待其贴满瓶底时，再按1:1的比例传入T175细胞培养瓶中，之后按1:4的比例在T175培养瓶中扩增，依次为4、16、64个T175培养瓶。

然后，将此64个T175培养瓶中的细胞消化、并收集计数后，接种到细胞培养生物反应器中，用含10％小牛血清的培养基扩增培养，控制温度为37℃，pH为7.2，溶解氧（DO）为50％，搅拌速度为70～150转/分钟。根据葡萄糖消耗和其它参数的变化来判断细胞的生长情况。通常接种细胞2～3天后，开始灌注培养，初始灌注量为2L/天，然后根据葡萄糖消耗情况逐渐增加灌注量，连续灌注3天后，即可更换为无血清培养。

2.1.2.3细胞在反应器中连续灌注培养

细胞在反应器中完成扩增培养后，压出有血清培养基，用P.B.S.清洗3次，换入无血清培养基进行连续灌注培养，灌注量在5～15L/天之间，持续培养30天左右，收获细胞上清约300升/罐/批，rhTNK-tPA的表达水平平均在18000IU/10⁶cell/d以上。所收获的细胞培养上清转入纯化。

2.1.2.4rhTNK-tPA的分离纯化

2.1.2.4.1过滤，将细胞培养收集的无血清培养上清经1.2微米微孔滤膜正压过滤，去除细胞碎片。

2.1.2.4.2Zn⁺⁺--POROS20MC螯合层析纯化

将已过滤的细胞上清进行吸附上样，上样完毕后，首先用流动相A（30mMP.B.S，0.01％Tween20，pH7.6）洗至上样峰下，然后用流动相B（30mMP.B，1.5MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6）洗至杂蛋白峰下，最后用流动相C（30mMP.B，0.5MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6，0.3M咪唑）洗至目标峰下，收集目标峰。

2.1.2.4.3LysineHyperD亲和层析

将上述目标峰收集液在LysineHyperD亲和层析柱上吸附上样，上样完毕后开始洗脱。首先用流动相D（30mMP.B.S，0.01％Tween20，pH7.6）洗至上样峰下，然后用流动相E（30mMP.B，1MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6）洗至杂蛋白峰下，最后用流动相F（30mMP.B，1MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6，1ML-Arginine）洗脱目标峰，收集该目标峰。

2.1.2.4.4SephadexG-25凝胶过滤层析

将上述目标峰收集液在SephadexG-25凝胶柱上上样，然后用流动相G（每1000毫升G液含60gL-Arginine，15g正磷酸，200毫克Tween20）洗脱，收集目标蛋白峰，即为rhTNK-tPA蛋白纯品。

3、rhTNK-tPA的鉴定

3.1非还原SDS-PAGE测定rhTNK-tPA纯度

采用SDS不连续电泳的方法测rhTNK-tPA纯度。

分离胶浓度是10％；浓缩胶浓度是5％；样品处理液是含0.5％溴酚蓝、1％SDS、10％甘油pH6.8的Tris-HClbuffer。样品与样品处理液等量混匀，上样量10微克（上样量中蛋白含量不到10微克时则按上样量上样）。电泳采用恒流30毫安，电泳时间约60分钟。电泳完毕用考马斯亮蓝法染色，其结果在68KD处有特征电泳带，根据扫描图象的结果可以得到rhTNK-tPA纯度约为98％。

3.2还原型SDS-PAGE测定rhTNK-tPA的分子量和单双链比例

电泳：除样品处理液加5％DTT外，其余条件与非还原SDS-PAGE相同。

分子量计算：根据分子量的对数与相对迁移率R_f是线性关系，依据Marker可以拟出线性方程：logM.V＝k×R_f+a

用直尺测出电泳带的迁移距离就可以得到相对R_f，代入上式即可得到蛋白分子量。

单链蛋白的分子量约为68KD，双链蛋白的轻链约为36KD，重链约为42KD。根据扫描图象即可得到单、双链比例在8:2以上。

3.3Westernblot鉴定rhTNK-tPA

电泳采用非还原SDS-PAGE的方法，固定膜是PVDF膜（使用前用甲醇泡0.5分钟，再用电极缓冲液漂洗0.5h），封阻液用10％BAS。转移电流用恒压100伏，转移1.5小时。一抗是rabbitantirec-t-PA，二抗是羊抗兔IgG-HRP，显色液是DAB；用预染Marker作分子量标志。

其结果在68KD处有特征带。

3.4rhTNK-tPAN-端氨基酸序列测定

rhTNK-tPAN-端氨基酸序列测定结果显示，N末端15个氨基酸顺序为Ser-Tyr-Gln-Val-Ile-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-Gln-Met-Ile-Tyr，与理论值一致。

3.5rhTNK-tPA生物学活性测定（气泡裂解法）

所用试剂：PBbuffer：29gNa₂HPO₄·12H₂O和3gNaH₂PO₄·2H₂O定溶1000毫升，pH7.4。2毫克/毫升纤维蛋白原溶液，0.1毫克/毫升纤溶酶原溶液，33IU/毫升溶液。标准品（3000IU/毫升，1500IU/毫升，750IU/毫升，375IU/毫升，187.5IU/毫升，98.75IU/毫升）。

样品处理：用PBbuffer稀释到t-PA含量约为750IU/毫升。

操作：将0.12毫升溶液和0.12毫升样品（t-PA）混匀，冰水浴保存（下称A液）。将1毫升溶液和20μl纤溶酶原在试管中混匀，冰水浴保存（下称B管）。取A液0.2毫升加入B管中，快速混匀，放入37℃恒温，开始记时间。当气泡上升到表面（全部，个别气泡沾到壁上可以不记）为终点，记录时间。

根据文献记载，该法Lg活性与Lg时间是线性关系的，因而可以拟合出线性方程。将样品的数据代入既可以得出数据。

结果表明，细胞培养上清的rhTNK-tPA含量平均在18000IU/10⁶cell/d以上，纯品的rhTNK-tPA比活性为600,000IU/毫克。

3.6rhTNK-tPA临床前动物试验结果

临床前动物试验结果表明，rhTNK-tPA对犬急性冠状动脉血栓、大鼠腹主动脉血栓、兔肺血栓、体外人血栓等有明显的溶栓作用；对小鼠一般行为状态、中枢神经系统作用不明显，对豚鼠回肠平滑肌收缩无影响；对犬心电图、呼吸频率和呼吸深度无影响；其猕猴药代动力学参数和曲线与参比品相近。小鼠的急性毒性试验表明，雌性小鼠的MTD大于3420.5毫克/千克，雄性小鼠大于3102.3毫克/千克；大鼠和犬的长期毒性试验表明，对其毒性靶器官肝脏的毒性反应具有可逆性；局部用药毒性试验表明，犬注射部位血管形态无异常，在血管周围软组织内见少量陈旧性出血并胞浆内含有含铁血黄素颗粒的巨噬细胞；致畸胎试验表明，对妊娠母鼠和胎鼠有轻微的毒性作用，但无明显的致畸胎性。^[2]

2018年12月20日，《生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法》获得第二十届中国优秀奖。^[1]